Western Blot 常见问题分析

前两周的(de)(de)“Western Blot 常(chang)见(jian)问题(ti)分(fen)析”中(zhong),我们主要分(fen)享了(le)一些异常(chang)的(de)(de)实验结果,今天我们来(lai)讲讲关于Western Blot实验可能会存在的(de)(de)疑惑.话不(bu)多说,直接上货：

1．Western实验中,用TBS还是PBS？

选(xuan)择(ze)合适(shi)的(de)缓(huan)(huan)冲液对于维持(chi)一定pH值下(xia)蛋白质的(de)稳定及(ji)保(bao)证实验的(de)重复(fu)性很重要.PBS的(de)缓(huan)(huan)冲能(neng)力强于TBS,TBS在pH7.0以下(xia)缓(huan)(huan)冲能(neng)力较弱(ruo).一般根(gen)据实验目的(de)选(xuan)用(yong)(yong)合适(shi)的(de)缓(huan)(huan)冲液,如在蛋白纯化中(zhong)进行(xing)阴(yin)离(li)子(zi)(zi)(zi)交换(huan)(huan)层(ceng)析,阳(yang)离(li)子(zi)(zi)(zi)缓(huan)(huan)冲液选(xuan)TBS；阳(yang)离(li)子(zi)(zi)(zi)交换(huan)(huan)层(ceng)析时,阴(yin)离(li)子(zi)(zi)(zi)缓(huan)(huan)冲液选(xuan)PBS.Western blot中(zhong)使用(yong)(yong)PBS和TBS均可,根(gen)据需要选(xuan)择(ze)合适(shi)的(de)浓度(du).

2. 没有注明可(ke)(ke)以用(yong)来(lai)做Western blot的一抗,可(ke)(ke)以用(yong)来(lai)做Western blot吗？

不一(yi)定(ding),因(yin)(yin)为(wei)有的(de)(de)抗(kang)(kang)体是(shi)(shi)识(shi)(shi)别(bie)线性表位(wei)的(de)(de),有的(de)(de)是(shi)(shi)识(shi)(shi)别(bie)构(gou)象(xiang)型(xing)(xing)(xing)表位(wei),识(shi)(shi)别(bie)构(gou)象(xiang)型(xing)(xing)(xing)表位(wei)的(de)(de)抗(kang)(kang)体不能用于Western blot,因(yin)(yin)为(wei)在Western blot中(zhong)抗(kang)(kang)体识(shi)(shi)别(bie)的(de)(de)是(shi)(shi)完全变性的(de)(de)蛋白质(zhi)抗(kang)(kang)原,而蛋白质(zhi)抗(kang)(kang)原的(de)(de)构(gou)象(xiang)型(xing)(xing)(xing)表位(wei)变性时被破(po)坏.

3．做Western每次只加一种(zhong)一抗,可以同时(shi)加两种(zhong)或者(zhe)多种(zhong)一抗吗？

不要(yao)同(tong)时加两种(zhong)一抗(kang)(kang),因为如果(guo)结果(guo)里(li)面(mian)有非特(te)异性(xing)信号(hao)的话(hua),就说(shuo)不清楚(chu).做(zuo)Western在同(tong)一张膜上(shang)检测目的蛋白和内(nei)(nei)对照(zhao)(zhao),也(ye)是(shi)先上(shang)目的蛋白的一抗(kang)(kang) 二抗(kang)(kang) ECL显色 压片 洗(xi)片,漂洗(xi)后加内(nei)(nei)对照(zhao)(zhao)的一抗(kang)(kang) 二抗(kang)(kang) ECL显色 压片,洗(xi)片.

4. Western用的一抗(kang),单抗(kang)好些还是多抗(kang)好些？

做Western来(lai)讲,理论上(shang)单抗(kang)(kang)比多抗(kang)(kang)的(de)(de)特(te)异(yi)性(xing)要好但(dan)价格偏高,一(yi)般(ban)来(lai)说多抗(kang)(kang)就(jiu)OK了.用于(yu)Western的(de)(de)抗(kang)(kang)体(ti)和用于(yu)ELISA的(de)(de)抗(kang)(kang)体(ti),一(yi)般(ban)来(lai)说用于(yu)Western的(de)(de)抗(kang)(kang)体(ti)识(shi)别(bie)的(de)(de)是(shi)氨基(ji)酸序列(lie)(lie)特(te)异(yi)性(xing),而可用于(yu)ELISA的(de)(de)抗(kang)(kang)体(ti)要看抗(kang)(kang)原种类,有(you)些是(shi)识(shi)别(bie)氨基(ji)酸序列(lie)(lie)特(te)异(yi)性(xing),有(you)些是(shi)识(shi)别(bie)构(gou)象(xiang)特(te)异(yi)性(xing),所以一(yi)般(ban)根(gen)据说明(ming)书来(lai)确定.做免疫(yi)印迹选择抗(kang)(kang)体(ti)主要考虑两个问题,一(yi)是(shi)所选抗(kang)(kang)体(ti)是(shi)否(fou)识(shi)别(bie)凝胶(jiao)电(dian)泳(yong)后转印至膜上(shang)的(de)(de)变性(xing)蛋白,另一(yi)个是(shi)所选抗(kang)(kang)体(ti)是(shi)否(fou)会引起交(jiao)叉反应条(tiao)带(dai).

5. 半(ban)干转是否要取(qu)膜(mo) 滤纸 胶(jiao)同样(yang)大小(xiao)(xiao),因为胶(jiao)大小(xiao)(xiao)不一(yi)定规则,膜(mo)和滤纸会(hui)大一(yi)点,那样(yang)会(hui)不会(hui)短路(lu)？

可(ke)以相等(deng),但是如果(guo)滤(lv)纸 膜比凝胶(jiao)大就比较容易(yi)形成短路(lu)了,上下两层(ceng)滤(lv)纸也不能因(yin)过(guo)大而相互(hu)接触,这样会短路(lu),电(dian)流不会通过(guo)胶(jiao)和滤(lv)纸.转(zhuan)移(yi)前(qian)和转(zhuan)移(yi)过(guo)程中看看电(dian)压就行(xing),正(zheng)常的(de)(de)半(ban)干转(zhuan)是慢(man)慢(man)变高(gao)的(de)(de),结束时一(yi)般(ban)是开始的(de)(de)1.5-3倍都是正(zheng)常的(de)(de).

6. 不能很好的将大分子量蛋白转移到膜(mo)上,转移效率(lv)低怎么解决？

大分(fen)子量蛋白倾向于(yu)在(zai)胶里(li)沉(chen)淀,阻碍转(zhuan)移.可以(yi)考虑：在(zai)转(zhuan)膜缓冲(chong)液里(li)加(jia)入终浓度0.1%的SDS有助于(yu)增加(jia)转(zhuan)移效率；转(zhuan)移缓冲(chong)液中加(jia)入20%甲醇(chun),甲醇(chun)可以(yi)降低(di)蛋白质洗脱(tuo)效率,增加(jia)蛋白质和NC膜的结合能力(li),防止凝胶变形,延长大分(fen)子量蛋白转(zhuan)移时间；用4℃湿转(zhuan)过夜代(dai)替半干法(fa)转(zhuan)膜.